A região atualmente ocupada por Niterói foi habitada, a partir de 4000 a.C., aproximadamente, por povos coletores, caçadores e pescadores que deixaram, como marcas de sua passagem, grandes vestígios arqueológicos, os sambaquis. Sambaquis (do tupi tamba, "concha" e ki, "depósito", significando "depósito de conchas"[1]) são os restos de conchas, esqueletos humanos, cerâmica, machados, ossos de animais, peixes e pontas de pedra de flechas que foram soterrados e que passaram por um processo de fossilização. Tais testemunhos são muito comuns no litoral brasileiro e são extremamente valiosos para que os arqueólogos de hoje possam compreender como funcionavam essas sociedades pré-históricas. Em Niterói, existe um grande sítio arqueológico de sambaquis ao lado da Duna Grande da Praia de Itaipu, na Região Oceânica. Bem perto deste sítio, se localiza o Museu de Arqueologia de Itaipu, que expõe os sambaquis que foram encontrados na região.
Por volta do ano 1000, no entanto, estes povos coletores foram expulsos ou destruídos por tribos invasoras de língua tupi, os chamados tupinambás ou tamoios, provenientes da Amazônia (provavelmente, da atual região do estado de Rondônia, no Brasil).
Os primeiros europeus a passarem pela região foram os portugueses na expedição de reconhecimento liderada por Gonçalo Coelho e Américo Vespúcio, que, em 1º de janeiro de 1502, descobriu a Baía de Guanabara, batizando-a "Rio de Janeiro". Porém, como não foram encontrados metais preciosos ou grandes impérios, a região não interessou aos portugueses.[2].
Devido ao descaso dos portugueses, traficantes franceses de pau-brasil estreitaram os laços com os tamoios, gerando uma sólida aliança comercial entre os dois povos. Em meados do século XVI, a França decidiu implementar um projeto de colonização na região da Baía de Guanabara, intitulado França Antártica. Em 1555, o navegador francês Nicolas Durand de Villegaignon chegou à Baía de Guanabara e se instalou na ilha denominada Serigipe pelos indígenas, no local atualmente ocupado pela Escola Naval, em frente ao Aeroporto Santos Dumont, no Centro do Rio de Janeiro. Ali, ele construiu o Forte Coligny, que seria arrasado em 1560 por uma expedição portuguesa liderada pelo governador-geral Mem de Sá. Ainda em 1555, foi construído, pelos franceses, um posto de observação na Praia de Fora, em Niterói, para vigiar a entrada da Baía de Guanabara[3].
Porém os sobreviventes franceses, aliados aos índios tupinambás, permaneceram na região e somente seriam definitivamente expulsos pelos portugueses em 1567. Nesse mesmo ano, os portugueses instalaram uma guarnição de artilharia na Praia de Fora, em Niterói, no antigo posto de observação francesa da entrada da Baía de Guanabara[4]. Em toda esta luta contra os tamoios e os franceses, os portugueses contaram com a ajuda valiosíssima dos índios temiminós, que habitavam originalmente a atual Ilha do Governador, na Baía de Guanabara, mas que haviam sido expulsos de lá pelos tamoios e franceses. Os temiminós, na ocasião, liderados por Maracajá-guaçu, se transferiram para a capitania do Espírito Santo, onde se converteram ao catolicismo, foram catequizados pelos jesuítas, fundaram a cidade de Serra e ajudaram os portugueses a expulsar invasores neerlandeses. Com a invasão francesa, os portugueses recrutaram os temiminós para que eles os ajudassem a expulsar os franceses.
Como recompensa pela ajuda, os portugueses ofereceram ao líder dos temiminós, Arariboia ("cobra da água de arara", traduzido do idioma tupi. Arariboia também possuía um nome cristão de batismo, Martim Afonso de Souza), que era filho do antigo chefe Maracajá-guaçu, a porção direita da entrada da Baía de Guanabara, enquanto os portugueses ocupariam a sua porção esquerda, a atual cidade do Rio de Janeiro. Tal forma de ocupação seria útil do ponto de vista estratégico para a defesa da baía. Arariboia aceitou e ocupou a região. Antes da ocupação da porção direita da entrada da Baía de Guanabara, os temiminós ainda ocuparam por algum tempo a região do atual bairro de São Cristóvão, no Rio de Janeiro. Em 1573, os temiminós se mudaram para a atual região de Niterói, que foi batizada, na ocasião, como São Lourenço dos Índios. Esse ano consta no atual brasão da cidade de Niterói. Na mesma época, um francês chamado Martin Paris, que havia traído seus compatriotas e ajudado os portugueses, recebeu do governo português uma sesmaria na atual região de São Francisco, como recompensa[5].
O aldeamento de São Lourenço dos Índios tinha uma posição estratégica: se localizava no alto de um morro, propiciando vista panorâmica da entrada da baía de Guanabara e era cercado de manguezais, o que dificultaria uma eventual invasão pela água. Foi na Igreja de São Lourenço dos Índios, em 10 de agosto de 1583, que ocorreu a primeira encenação da mais famosa peça do jesuíta José de Anchieta: Jesus na Festa de São Lourenço[6]. Porém, a partir de 1587, com a morte de Arariboia, que se afogou nas imediações da Ilha de Mocanguê, São Lourenço dos Índios entrou em decadência[7]. Em 1596, a bateria instalada na Praia de Fora rechaçou uma tentativa de invasão neerlandesa chefiada por Van Noorth[8].
Melhor sorte tiveram os núcleos de colonização portuguesa que se estabeleceram nos atuais bairros de São Domingos, Icaraí, Piratininga e Itaipu. Em Piratininga, os jesuítas possuíam a Fazenda do Saco, que produzia gêneros alimentícios para o Colégio dos Jesuítas, na cidade do Rio de Janeiro, então chamada de São Sebastião do Rio de Janeiro. Os núcleos de colonização em Icaraí, Itaipu e São Lourenço foram elevados à condição de freguesias durante os séculos XVII e XVIII, sob os nomes de São João Batista de Icaraí, São Sebastião de Itaipu e São Lourenço. Em 1650, foi construída a Igreja de Boa Viagem, na ilha de mesmo nome. Entre os séculos XVII e XVIII, foi construído o Forte do Gragoatá. Em 1715, foi iniciada a construção do Forte São Luís em um pico localizado ao lado da Fortaleza de Santa Cruz, para reforçar a defesa da entrada da Baía de Guanabara. O forte foi fundado em 1775[9]. Em 17 de agosto de 1751, foi inaugurada a Capela de São Pedro, na fazenda homônima, na Enseada do Maruí[10].
Por esta época, as principais atividades produtivas de Niterói eram a pesca da baleia, a agricultura, a pecuária e a produção de açúcar, de farinha de mandioca e de peixe salgado. As baleias eram pescadas na Baía de Guanabara, região muito procurada pelas baleias, originando as chamadas "armações", ou seja, locais onde se reuniam os barcos baleeiros. Dessa época, vem o nome do bairro atual da Ponta da Armação, também chamada de ponta d´Areia ou Portugal Pequeno. Vale lembrar que o óleo extraído das baleias era muito utilizado na época como argamassa de material de construção das casas. Os gêneros alimentícios produzidos por Niterói abasteciam a cidade de São Sebastião do Rio de Janeiro. Restos arquitetônicos desta época são a Fortaleza de Santa Cruz, o Convento de Santa Tereza (que atualmente abriga o Museu de Arqueologia de Itaipu), a Igreja de São Sebastião de Itaipu, a Igreja de Nossa Senhora do Bonsucesso de Piratininga, a Igreja de São Francisco Xavier (que deu o nome ao bairro e praia de São Francisco e cuja inscrição charitas, na entrada, que significa "caridade", em latim, deu o nome à atual Praia de Charitas) em São Francisco e a Igreja de Nossa Senhora da Conceição no Centro de Niterói.
Niterói teve papel destacado em dois ataques de piratas franceses ao Rio de Janeiro durante o século XVIII. Na primeira, o francês Duclerc foi rechaçado pelos canhões da Fortaleza de Santa Cruz e pela Bateria da Praia de Fora, obrigando-o a se afastar e atacar o Rio de Janeiro pela retaguarda, por Sepetiba. Porém esta manobra dificultou o avanço de Duclerc, que foi vencido com facilidade pela população do Rio de Janeiro. Na segunda invasão, efetuada pouco após por Duguay-Trouin em vingança pela morte de Duclerc, os moradores da cidade do Rio de Janeiro tiveram que pagar um resgate de 610 000 cruzados, duzentos bois e cem caixas de açúcar. Os cruzados foram doados pelos habitantes do Rio de Janeiro, porém os bois e o açúcar tiveram que ser pagos pela população da "banda d´além", o que demonstra a importância da agropecuária em Niterói e nas regiões vizinhas (São Gonçalo e Itaboraí) na época.
Em 1819, atendendo aos apelos da população, o rei dom João VI, que costumava passar temporadas de férias no bairro de São Domingos, elevou a região à condição de vila: a Vila Real de Praia Grande. Esta data também consta do brasão da cidade atualmente. No ano seguinte, foi feito um plano de arruamento da cidade, ordenando o centro da cidade em ruas segundo uma disposição quadriculada que se mantém até hoje. Foi a primeira forma de planejamento urbano de uma cidade brasileira[11]. O projeto era da autoria do francês Arnaud Julien Pallière e do major engenheiro brasileiro Antônio Rodrigues Gabriel de Castro[12].
Em 1824, foi construída a Casa da Câmara e Cadeia, no Largo de São João, no lugar de um antigo cemitério indígena, obedecendo ao planejamento urbanístico de Pallière. Em 1826, João Caetano estreou, num pequeno palco da Rua 15 de Novembro, no Centro, a sua Companhia Dramática Nacional. Segundo alguns, este foi o marco de fundação do teatro brasileiro[13].
Em 1832, o cientista inglês Charles Darwin passou pela cidade. Ele estava em uma expedição científica ao redor do mundo. Os dados coletados por ele nessa expedição serviram de base para ele formular a sua revolucionária teoria da evolução das espécies. Darwin, após visitar a cidade do Rio de Janeiro, atravessou a Baía de Guanabara e se dirigiu, a cavalo, até a cidade de Conceição de Macabu. Em Niterói, visitou particularmente a região da Serra da Tiririca[14].
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